см меню

НАБОР НД

X
ND Kit
  • Предназначено для: птиц
  • Фасовка: 100 тестов

 

 

ОБЩЕЕ ОПИСАНИЕ

Набор НД представляет собой комплекс для выявления и установления титра антител против болезни Ньюкасла в сыворотке крови птиц путем микрометода реакции торможения гемагглютинации

 

Набор используется для диагностики, а также для оценки иммунного состояния птиц. 

Более подробно

КОМПОНЕНТЫ

Лиофилизированный антиген НДВ – раствор с содержанием вируса, штамм «Ла Сота». Гемагглютинирующий титр (THA) указан на этикетке флакона.

Положительная, лиофилизированная сыворотка НДВ. Замедленно гемагглютинирующий титр (TНГА) указан на этикетке флакона.

 

Отрицательная, лиофилизированная сыворотка Растворитель для антигена и сывороток 

 

Компоненты Кол-во на 100 проб Кол-во на 250 проб Кол-во на 500 проб
Антиген (лиофил.) фл. x 1  мл фл. x 1  мл фл. x 1  мл
Сыворотка положит. (лиофил.) фл. x 1  мл фл. x 1  мл фл. x 1  мл
Сыворотка отриц. (лиофил.) фл. x 1  мл фл. x 1  мл фл. x 1  мл
Растворитель фл. x 4  мл фл. x 6  мл фл. x 10  мл
Инструкции по использованию набора копия. копия. копия.

 

МЕТОД РАБОТЫ

1. Термическое уравновешивание реагентов

Компоненты набора необходимо довести до комнатной температуры (~20°C) по меньшей мере за 30 минут до начала работы

2. Подготовка фосфатно-солевого буфера (ФСБ) в лаборатории

- Взвесьте и растворите в дистиллированной или деионизированной воде следующие вещества:

- хлористый натрий (NaCl) ………..…...…...…...…..... 9 гр.

- динатрийфосфат с 12 молекулами воды (Na2HPO4 x 12 H2O) …..…......……...…...…...…...……………………..1,35 гр.

- мононатрийфосфат с 1-ой молекулой воды

(NaH2PO4 x H2O)………..…......……...…...…...…...…..0,36 гр.

- дистиллированная или деионизированная вода ..……...…...…...…...……………………………………..1 литр.

Откорректируйте pH полученного раствора до 7,2 7,4. Можно простерилизовать полученный раствор паром в течение 20 минут при температуре 121°C. Хранить фосфатно-солевой буфер можно при температуре 2 8°C долгое время.

3. Приготовление раствора эритроцитов

У тестируемых птиц не должно быть антител против вируса Ньюкасла. Эритроциты собираются из подкрыльцовой вены и помещаются в раствор Альсевера;

Перед использованием, эритроциты пропускают через центрифугу и промывают раствором ФСБ по меньшей мере три раза (10-15 минут в центрифуге при скорости 1000 1200 об/мин);

Раствор с эритроцитами можно хранить, 4-5 дней при температуре 2 8°C. Для этого полученные после центрифуги эритроциты необходимо поместить в раствор ФСБ в пропорции 1 к 2;

При тестировании используется концентрация раствора с эритроцитами в ФСБ 1% (например: 0,5 мл раствора с эритроцитами + 49,5 мл. ФСБ).

4. Проверка компонентов набора НД

 

4.1. Проверка титра HA антигена

Приготовление антигена: антиген поставляется в форме лиофилизированной таблетки бело-желтоватого цвета. Таблетку (1 флакон антигена) необходимо растворить в 1 мл растворителя – при этом получается неочищенный антиген. При микрометоде НГА используются 4 гемагглютинирующие единицы. Для приготовления рабочего раствора антигена (с титром

HA, содержащим 4 ед.UHA), разделите титр антигена, указанный на этикетке на 4.

Например: титр антигена, указанный на этикетке, составляет 256, тогда титр HA будет 256:4 = 64. То есть, неочищенный антиген надо разбавить в пропорции 1:64к одному мл неочищенного антигена добавляется 63 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ).

(Примечание: количество приготовляемого антигена зависит от количества проб, тем не менее, указанная пропорция обязательна, например 0,1 мл неочищенного антигена + 6,3 мл ФСБ).

Проверка антигена: осуществляется путем прямой гемагглютинации (микрометод):

a) в пластине для микрореакций с лунками с круглым дном или дном в форме V – распределяются в первых горизонтальных рядах (A, B, C и D) по 25 мкл ФСБ;

b) в первую лунку ряда A, B и C добавляется по 25 мкл неочищенного антигена. Перемешайте смесь при помощи пипетки – в использованных лунках неочищенный антиген разбавлен на ½;

c) проведите серийное разведение при помощи автоматической пипетки (1/4, 1/8, 1/16….1/4096), перенося по 25 мкл из одной лунки в другую. После каждого переноса перемешайте полученную смесь, забирая раствор в пипетку и вновь отпуская в лунку. Серийное разведение проводится до последней лунки рядов A, B и C (ряд 12 по вертикали). Из последних лунок необходимо удалить по 25 мкл раствора;

d) во все лунки рядов A, B, C и D добавляется по 25 мкл ФСБ;

e) во все лунки рядов A, B, C и D добавляется по 25 мкл 1% раствора эритроцитов в ФСБ;

f) теперь пластину необходимо несильно встряхнуть и оставить при комнатной температуре (~20°C) на 40 минут или при температуре 4°C на 60 минут;

g) по истечении указанного времени реакции в ряду D (опознаватель эритроцитов) раствор с эритроцитами должен отложиться в форме четкого «узелка». Гемагглютинирующий титр антигена показан в последней лунке, где эритроциты обнаружены в растворе (отсутствие «узелка» служит признаком гемагглютинации). Гемагглютинация должна проходить равномерно хотя бы в двух их трех рядов A, B и C.

Гемагглютинирующий титр должен соответствовать показанию на этикетке флакона с антигеном.

4.2. Проверка титра НГА для положительной сыворотки

Приготовление сыворотки: положительная сыворотка поставляется в форме лиофилизированной бело-желтоватой таблетки. Таблетку разводят в 1 мл. ФСБ / флакон положительной сыворотки, получая при этом неочищенную положительную сыворотку (чей титр НГА и проверяется). Неочищенную сыворотку, разведенную в 1 мл ФСБ далее разводят согласно титру, НГА, указанному на этикетке или полученному после

проверки. Например: титр НГА, указанный на этикетке, составляет 1/256. Положительную сыворотку с 1 мл. ФСБ разводят в пропорции 1:256, то есть на 1 мл. сыворотки добавляют 255 мл. ТФС.

(Примечание: положительную сыворотку можно готовить и в других количествах, но обязательно в этих пропорциях, например: 0,1 мл регидрированной сыворотки + 25,5 мл ФСБ).

Проверка положительной сыворотки: осуществляется путем замедления гемагглютинации (микрометод):

a) в пластине для микрореакций с лунками с круглым дном или дном в форме V –распределяются в первых горизонтальных рядах (A, B, C и D) по 25 мкл ФСБ;

b) в первую лунку ряда A, B и C добавляется по 25 мкл регидрированной положительной сыворотки. Перемешайте смесь при помощи пипетки – в использованных лунках неочищенный антиген разбавлен на ½;

c) проведите серийное разведение при помощи автоматической пипетки (1/4, 1/8, 1/16….1/4096), перенося по 25 мкл из одной лунки в другую. После каждого переноса перемешайте полученную смесь, забирая раствор в пипетку и вновь отпуская в лунку. Серийное разведение проводится до последней лунки рядов A, B и C (ряд 12 по вертикали). Из последних лунок необходимо удалить по 25 мкл раствора;

d) во все лунки рядов A, B, C и D добавляется по 25 мкл антигена, разведенного в соответствии с титром, указанным на этикетке (с содержанием 4 UHA);

e) теперь пластину необходимо несильно встряхнуть и оставить при комнатной температуре (~20°C) на 30 минут или при температуре 4°C на 60 минут;

f) по истечении времени реакции, во все лунки рядов A, B, C и D добавляется по 25 мкл 1% раствора эритроцитов в ФСБ;

e) теперь пластину необходимо несильно встряхнуть и оставить при комнатной температуре (~20°C) на 40 минут или при температуре 4°C на 60 минут;

f) по истечении указанного времени реакции в ряду D (опознаватель эритроцитов) раствор с эритроцитами должен отложиться в форме четкого, красного «узелка»; а в лунках ряда С (опознаватель антигена) эритроциты должны оставаться в форме раствора (отсутствие «узелка»). В рядах A и B, от первой лунки до лунки с раствором, соответствующим титру НГА на этикетке, должны наблюдаться красные «узелки». Это служит признаком замедления гемагглютинации в силу присутствия антител против вируса Ньюкасла в сыворотке. В следующих лунках эритроциты должны оставаться в форме раствора (без формирования «узелков», так же, как и в лунках ряда С (опознаватель антигена).

i) Замедляющий гемагглютинацию титр положительной сыворотки определяется последней лункой, в которой наблюдается узелок эритроцитов (в следующих эритроциты остаются в растворе).

Замедляющий гемагглютинацию титр положительной сыворотки должен быть идентичным в рядах А и В.

Установленный титр замедления гемагглютинации должен совпадать с показателем на этикетке флакона положительной сыворотки.

4.3. Отрицательная сыворотка

Приготовление отрицательной сыворотки: отрицательная сыворотка поставляется в форме лиофилизированной бело-желтоватой, желто-красной таблетки. Таблетку разводят в 1 мл. ФСБ / флакон отрицательной сыворотки, получая при этом готовую к использованию отрицательную сыворотку.

5. Проверка сывороток при помощи набора НД

Инактивация сывороток: Инактивация сывороток осуществляется на водяной бане, при температуре 56°C, в течение 30 минут. Тестирование не проводится на гемолизированных или зараженных бактериями сыворотках. После инактивации сыворотки можно хранить 30 дней при температуре 20°C.

Реакция НГА:

a) при помощи многоканальной пипетки в каждую лунку пластины для реакций помещается 25 мкл ФСБ (лунки с круглым дном или в форме V);

b) В каждую лунку первой колонки помещается по 25 мкл от каждой из тестируемых сывороток;

c) Для каждой сыворотки проводится серийное разбавление log2, до колонки 10 для первой пластины (1/2,1/4,…1/1024), а потом до последней колонки (12) для последующих пластин (1/2, 1/4,...1/4096); из последней лунки серийного разбавления удаляется 25мкл раствора;

d) в лунки A, B, C şi D колонки 11 добавляется 25 мкл положительной сыворотки, разбавленной согласно п. 4.2, а в лунки E, F, G и H колонки 11 добавляется 25 мкл регидрированной отрицательной сыворотки;

e) затем в лунки добавляется по 25 мкл приготовленного по рабочему методу антигена (согласно титру, 4 UHA), за исключением лунок E, F, G и H из колонки 12, куда добавляется по 25 мкл ФСБ (эти лунки являются определителем эритроцитов); для этих действий можно использовать многоканальную пипетку;

f) теперь пластину необходимо несильно встряхнуть и оставить при комнатной температуре (~20°C) на 30 минут или при температуре 4°C на 60 минут;

g) по истечении времени реакции, во все лунки пластины добавляется по 25 мкл 1%-го раствора эритроцитов кур, заготовленного в ФСБ. для этих действий можно использовать многоканальную пипетку;

h) теперь пластину необходимо несильно встряхнуть и оставить при комнатной температуре (~20°C) на 40 минут или при температуре 4°C на 60 минут;

 

По истечении времени реакции, необходимо провести считывание реакций, сравнивая результаты в лунках с содержанием сывороток с результатами в лунках колонок 11 и 12, содержащих положительную и отрицательную сыворотку, определитель антигена и определитель эритроцитов. Титр замедления гемагглютинации отражается в последней лунке с тестируемой сывороткой, в которой образовался «узелок» эритроцитов. 

 

ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ПРАВИЛЬНОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ 

Результаты теста являются правильными если:

- при титрировании антигена (развед. в 1 мл. ФСБ) получено значение HA, равное указанному на этикетке флакона;

- при титрировании положительной сыворотки (развед. в 1 мл. ФСБ) получено значение НГА, равное указанному на этикетке флакона; допускается вариация до ± 1 логарифмической единицы log2 по отношению к показателю НГА, указанному на упаковке;

 

- титр отрицательной сыворотки меньше 4 (разведение в пропорции 1/4).

 

РЕЗУЛЬТАТЫ

 

Титр НГА отражается в лунке, где замедление гемагглютинации прошло на 100%, то есть «узелок» эритроцитов идентичен «узелку» в лунке – определителе эритроцитов (колонка 12 E, F, G, H). В таблице ниже указаны критерии толкования результатов согласно стандартам OIE (антиген с 4 UHA):

 

Показатель титр НГА (TНГА) TНГА ≤ 4 Отрицательный
TНГА =  8 Подозрение
TНГА ≥ 16 Положительный

 

Результаты теста интерпретируются в зависимости от данных о птицах (возраст, прививки и т.д.). Проверку можно повторить при необходимости. Рекомендуется повторить пробы с показателем TНГА = 8 (подозрение). Для подтверждения результатов можно провести и другие тесты.

 

Ниже представлена таблица, отражающая нормальные результаты среди популяций птиц, регулярно проходящих вакцинацию против болезни Ньюкасла: 

Уровень титра Значение
1/2 – 1/4 отрицательно
1/8 Незначительно, точно нет защиты
1/16 – 1/64  (для мин. 75%  проб) Вакцинация живой вакциной с питьевой водой обеспечивает надежную защиту
1/32 – 1/128  (для мин. 75% проб) Вакцинация живой вакциной путем введения в конъюнктиву глаза или методом распыления обеспечивает надежную защиту  
1/128 – 1/512  (для мин. 75% проб) 2 4 вакцинации живой вакциной обеспечивают надежную защиту
1/512 – 1/2048  (для мин. 75% проб) - высокий иммунитет за счет регулярных вакцинаций живыми вакцинами (более 5 вакцинаций) или повторные вакцинации инактивными вакцинами или - при титрах более обычных для тестируемых птиц (например, у молодняка 1/4096): подозревается болезнь.

 

НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ, НЕ ВКЛЮЧЕННЫЕ В НАБОР

- моно и мультиканальные измерительные пипетки (на 25 l);

- раствор с эритроцитами 1%;

- пластины для микрореакций с 96 лунками (дно круглое или в форме V);

- фосфатно-солевой буфер pH 7,2 7,4;

- стеклянные инструменты для лаборатории;

 

- хронометр.

 

ПРИМЕЧАНИЯ

Компоненты набора используются только вместе.

 

Антиген, растворенный в 1 мл. ФСБ (регидрированный) необходимо использовать немедленно или можно хранить при температуре 2 8°C не более 72 часов. Перед реакцией все реагенты необходимо довести до температуры комнаты (~20°C).

 

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ

Хранить набор НД при температуре 2 8°C.

 

Срок годности: 1 год с даты выпуска.

 

ФОРМА ВЫПУСКА

 

Наборы на 100 тестов.

 

ПРОИЗВОДИТЕЛЬ: Коммерческое общество ПАСТЕР ФИЛИПЕШТЬ, МЕСТО ПРОИЗВОДСТВА: Ш. ДЖУЛЕШТЬ, 333, СЕКТОР 6, БУХАРЕСТ, РУМЫНИЯ 

Продукты из категории: Реагенты для птиц